調(diào)節(jié)柯勒照明是獲得最佳圖像質(zhì)量的首要且必需的步驟。其核心目標是提供均勻、明亮且無眩光的照明，并使物鏡的分辨率得到充分發(fā)揮。以下是標準調(diào)節(jié)步驟：
第一步：基礎準備
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開啟顯微鏡電源，將光強調(diào)至中等亮度。
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放置一個染色適中的樣本，使用10倍物鏡，常規(guī)調(diào)焦至圖像清晰。
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將聚光鏡升至最高位置，并將孔徑光闌開至最大（約80%）。
第二步：調(diào)節(jié)視場光闌（關鍵步驟）
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找到并緩慢關小視場光闌（通常位于顯微鏡底座或聚光鏡側(cè)面），直到在視野中看到一個清晰的多邊形光斑。
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如果這個多邊形不在視野中央，使用聚光鏡兩側(cè)的對中調(diào)節(jié)螺絲，將其精確調(diào)整至視野中心。
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緩慢開大視場光闌，直到其邊緣剛好消失于視野之外。這一步能最大限度地消除雜散光，提高圖像對比度。
第三步：調(diào)節(jié)聚光鏡焦點（實現(xiàn)“柯勒”的關鍵）
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注視視野，緩慢下降聚光鏡（使用其專用的升降旋鈕）。
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在下降過程中，你會看到視場光闌邊緣的圖像（即那個多邊形）從模糊變清晰再變模糊。將其調(diào)節(jié)到最清晰的狀態(tài)。此時，光源燈絲恰好被聚焦在樣本平面，樣本則被聚焦在目鏡中，滿足了柯勒照明的核心條件。
第四步：調(diào)節(jié)孔徑光闌（控制分辨率與對比度）
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取下一個目鏡，通過聚焦望遠鏡或按下伯特蘭透鏡觀察物鏡的后焦面（此時會看到一個明亮的光圓）。
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調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使光圓直徑調(diào)整為物鏡后焦面直徑的70%-80%。若無專用工具，可在目鏡中憑經(jīng)驗調(diào)節(jié)：調(diào)小光圈可增加圖像反差但會降低分辨率；通常調(diào)節(jié)到圖像反差剛好令人滿意，且無明顯衍射偽影為宜。切勿將孔徑光闌用作亮度調(diào)節(jié)工具，亮度應僅由光強旋鈕控制。
第五步：最終檢查與切換物鏡
完成調(diào)節(jié)后，視野應明亮均勻。當切換不同倍數(shù)物鏡時，需要：
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重新檢查并微調(diào)聚光鏡焦點（因不同物鏡的工作距離不同）。
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重新調(diào)節(jié)孔徑光闌，以匹配新物鏡的數(shù)值孔徑。
重要提示：一旦為某臺顯微鏡調(diào)節(jié)好柯勒照明，通常只需在更換物鏡或大幅調(diào)整后重新進行第二步的后半部和第四步。熟練掌握此流程是進行高質(zhì)量顯微成像的基本功。
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